Methoden der diagnostischen Hämatologie

Heinz Huber, ehemaliger Extraordinarius an der Medizinischen Fakultät Innsbruck, Präsident der Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie und Professor für Innere Medizin/Onkologie am Wiener Allgemeinen Krankenhaus. Nach der Emeritierung 2001 Studium der Geschichtswissenschaften an der Universität Innsbruck.

Mit dem nun separat publizierten Methodenteil der Diagnostischen Hämatologie wurde gezielt den Bedürfnissen von Diagnoselaboratorien in Kliniken und Praxen entsprochen. Neben den aktualisierten hämatologischen, cytochemischen und immunologischen Techniken werden nun auch neueste molekularbiologische Diagnosemethoden ausführlich beschrieben.
Leicht nachvollziehbare Protokolle und eine logische Strukturierung mit Marginalien zur raschen Orientierung macht dieses Methodenbuch zu einer unentbehrlichen Arbeitsvorlage für jedes Diagnoselabor.

I Allgemeine Methoden bei hämolytischen Anämien.- 1 Osmotische Resistenz der Erythrozyten.- 1.1 Osmotische Resistenz aus frisch entnommenem Blut.- 1.1.1 Normalbereich.- 1.1.2 Bewertung und Besprechung.- 1.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 1.2 Osmotische Resistenz nach 24 Stunden Inkubation.- 1.2.1 Normalbereich.- 1.2.2 Bewertung und Besprechung.- 2 Plasmahämoglobin.- 2.1 Bestimmung des Plasmahämoglobins mittels Spektralfotometer.- 2.1.1 Normalwerte: unter 1,0 mg/100 ml.- 2.1.2 Besprechung.- 2.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 2.2 Weitere Methoden.- 2.2.1 Benzidinmethode.- 2.2.2 Bestimmung von freiem Hämoglobin in Heparinplasma und Serum..- 3 Heinz-Körper-Test.- 3.1 Normalwerte.- 3.2 Besprechung.- 4 Screening-Tests bei paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie.- 4.1 Sucrose-Hämolyse-Test.- 4.1.1 Besprechung.- 4.2 Säure-Serum-Test (Ham-Test).- 4.2.1 Besprechung.- Literatur.- II Erythrozytenenzymdefekte als Ursache angeborener hämolytischer Anämien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Hämolysatherstellung.- Literatur.- III Defekte der Erythrozytenmembran als Ursache angeborener hämolytischer Anamien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.- 4 Spektrin- und Ankyrin-Quantifizierung mittels ELISA.- 5 Strukturuntersuchung des Ankyrins.- 6 Strukturuntersuchung des Spektrins.- 7 Intraerythrozytäre Kalium- und Natrium-Konzentration.- Literatur.- IV Anämien aufgrund von Störungen der Hämoglobinsynthese und -Struktur.- 1 Einleitung.- 2 Hämoglobinelektrophorese.- 2.1 Zellulose-Azetat-Elektrophorese.- 2.2 Stärkegelelektrophorese.- 2.3 Zitrat-Agar-Gelelektrophorese.- 3 Hämoglobinstabilitäts-Tests.- 3.1 Methyl-Violett-Test.- 3.2 Brillant-Kresylblau-Test.- 3.3 Isopropanol-Test.- 3.4 Hitzestabilitäts-Test.- 4 Säulenchromatographie zur Hämoglobinanalyse.- 5 Hämoglobin F.- 5.1 Alkalidenaturierung.- 5.2 Säure-Elution.- 6 Hämoglobin A2.- 6.1 Hämoglobin A2-Messung.- 7 Hämoglobin S.- 7.1 Hämoglobin S-Löslichkeitstest.- 7.2 Sichelzelltest.- Literatur.- V Serologische Methoden für die Diagnose medikamenteninduzierter und autoimmunhämolytischer Anämien.- 1 Einleitung.- 2 Direkter Antiglobulin-(Coombs)-Test (DAT).- 3 Methoden zur Charakterisierung von Antikörpern in Serum und Eluaten.- 3.1 Enzymbehandelte Erythrozyten.- 3.2 Lösungen mit niedriger NaCl-Ionen-Konzentration (LISS).- 3.3 Herstellung von Eluaten aus Patientenerythrozyten.- 3.4 Screening-Untersuchungen für Serumantikörper.- 3.5 Spezifische Diagnosetests bei autoimmunhämolytischer Anämie.- 3.6 Medikamentös induzierte immunhämolytische Anämien.- Literatur.- VI Untersuchungen bei monoklonalen Gammopathien und immunologischen Defektzustanden.- 1 Biologische Bedeutung von monoklonalen Immunglobulinen.- 2 Nachweis von M-Gradienten in Serum und Harn.- 2.1 Probenvorbereitung.- 2.2 Proteinelektrophorese.- 2.3 Immunelektrophorese.- 2.4 Immunfixation.- 2.5 Berechnung eines monoklonalen Anteils aus quantitativen Immunglobulinbestimmungen.- 2.6 Nachweis und Differenzierung von Kryoglobulinen.- 3 Monoklonale Gammopathie unbekannter Signifikanz (MGUS).- Literatur.- VII Zytogenetische Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Möglichkeiten und Perspektiven der Tumorzytogenetik.- 3 Probenmaterial.- 4 Zellkultivierung und Herstellung der Chromosomenpräparate.- 4.1 Direktpräparation der Chromosomen.- 4.2 Kurzzeitkultivierung verschiedener Gewebe und zytogenetische Preparation.- 4.3 Langzeitkultivierung.- 4.4 Chromosomenfärbungen.- 4.4.1 Giemsa-Bandenfärbung mit 2X SSC-Vorbehandlung (GAG).- 4.4.2 Fluoreszenz-Bandenfärbung mit Quinacrin-Mustard (QFQ).- 4.4.3 C-Bandenfärbung mit Barium-Hydroxyd-Vorbehandlungen (CBG).- 4.4.4 Silberfärbung der aktiven Nukleolus-Organisation-Regionen an akrozentrischen Chromosomen (= Ag-NOR-Färbung).- 5 Auswertung.- 6 Zytogenetische Terminologie.- 7 Chromosomenanomalien und ihre Bezeichnung.- 7.1 Numerische Chromosomenanomalien.- 7.2 Strukturelle Chromosomenanomalien.- Literatur.- VIII Interphasenzytogenetik mittels Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH).- 1 Einleitung.- 2 Methodik.- 3 Anwendungen von FISH und Ausblick.- Literatur.- IX Zytochemische Methoden.- 1 Einleitung.- 2 Substanznachweismethoden.- 2.1 Eisen (Berliner Blau-Reaktion).- 2.2 PAS (Periodic Acid-Schiff)-Reaktion.- 2.3 Metachromasie-Nachweis mit Toluidinblau.- 2.4 Sudan-Schwarz-B-Färbung.- 3 Enzymnachweismethoden.- 3.1 Peroxidase-Reaktion (POX).- 3.2 Hydrolasen.- 3.2.1 Alkalische Phosphatase.- 3.2.2 Saure Phosphatase-Reaktion (SPh).- 3.2.3 Esterasenachweis mit Naphtylacetat oder Naphtylbutyrat ("neutrale Esterase").- 3.2.4 Saure Esterase-Reaktion (SEst).- 3.2.5 Chloracetat-Esterase.- 3.2.6 Dipeptidylaminopeptidase IV (DAP IV)-Methode.- 3.3 TDT (Terminale Deoxynucleotidyltransferase) Immunfluoreszenztechnik.- 4 Anhang.- 4.1 Fixierung (geeignet für: Esterase, saure Phosphatase, DAP IV).- 4.2 Natriumnitritlösung, 4%.- 4.3 Pararosanilinlösung, 4%.- X Immunzytologie und Knochenmarkimmunhistologie.- 1 Einleitung.- 2 Präparationsmethoden.- 2.1 Untersuchungsmaterial.- 2.1.1 Knochenmark.- 2.1.2 Zytopräparate.- 2.2 Färbungen.- 3 Diagnostik immunhistologischer Knochenmarkbiopsien.- 3.1 Zellularität.- 3.2 Verteilung der hämatopoetischen Zellen im normalen Knochenmark..- 3.3 Infiltrationsmuster.- 3.4 Fibrose und Sklerose.- 3.5 Reaktionsmuster mit applizierten Antikörpern.- 4 Anwendungsgebiete.- 4.1 Lymphome.- 4.2 Therapiemonitoring am Beispiel der Haarzelleukämie.- 4.3 Akute Leukämie.- 4.4 Seltene Indikationen.- 5 Ausblick.- Literatur.- XI Durchflußzytometrie.- 1 Einleitung.- 2 Aufbau des Durchflußzytometers.- 2.1 Probenzuführung.- 2.2 Messung der Lichtstreuung.- 2.3 Messung der Fluoreszenz.- 2.4 Signalverarbeitung und Messung.- 3 Praparationsmethoden.- 3.1 Peripheres Blut/Knochenmarkaspirat (PB/KMA).- 3.2 Untersuchung von Bronchiallavagen, Punktaten und Lymphknoten...- 3.3 Oberflächentest.- 3.3.1 Oberflächenfarbung mit direkt markierten Antikörpern.- 3.3.2 Arbeit mit indirekten Antikörpern.- 3.4 Fixierung und Einfrieren von Proben.- 3.5 Nukleäre Antigene.- 3.5.1 Ki67.- 3.5.2 Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT).- 3.6 Intrazelluläre Antigene am Beispiel der Myeloperoxidase (MPO).- 3.7 Messung des DNA Gehalts.- 3.7.1 Durchflußzytometrische Beurteilung der DNA.- 3.7.2 Preparation von Zellen zur DNA Bestimmung.- 3.7.3 DNA-Messung.- 3.8 Messung des Rhodamin Effluxes (MDR).- 3.9 Respiratory Burst/Phagozytenaktivitat.- 3.10 Andere Präparationsmethoden.- 4 Analyse.- 4.1 Charakterisierung des normalen Knochemarks.- 4.1.1 Erythroide Reihe.- 4.1.2 Lymphoide Zellen.- 4.1.3 Myelomonozytäre Linie.- 4.2 Durchflußzytometrische Charakterisierung des peripheren Blutes.- 4.3 Pathologische Veranderungen.- 4.3.1 Leukämien.- 4.3.2 Lymphome.- 4.3.3 Myeloproliferative Erkrankungen.- 4.3.4 AIDS-Monitoring.- Literatur.- XII In situ-Hybridisierung.- 1 Einleitung.- 2 Arbeitsgrundlagen.- 3 Wahl der Probe.- 3.1 DNA- und RNA-Sonden.- 3.2 Radioaktive Nachweismöglichkeiten für DNA und RNA.- 3.3 Nicht-radioaktive Proben.- 3.4 Labeling der Proben.- 3.5 Determination der Probengröße und der Reinigung der Proben.- 3.6 Einfluß der Probenlänge auf die Hybridisierungseffizienz.- 4 Detektionssysteme für nicht radioaktive Methoden.- 5 Preparation der Objekttrager.- 5.1 Anmerkungen.- 6 Zellgewinnung von Zytopräparaten und Schnitten.- 6.1 Zell- und Gewebsaufbereitung von Blut bzw. Knochenmark.- 6.2 Präparatherstellung.- 6.2.1 Zytopsin von Zellsuspensionen.- 7 Permeabilisierung der Zellen.- 8 Prähybridisierung (RNA-Nachweis).- 9 Denaturierung der Target DNA bei DNA/DNA in situ Hybridisierungen.- 10 Hybridisierung.- 10.1 Anmerkungen.- 11 Posthybridisierung.- 11.1 Waschen der Präparate.- 11.2 RNAse-Nachverdau.- 11.3 Dehydrieren.- 11.4 Befilmen.- 11.5 Exposition.- 11.6 Entwicklung.- 11.7 Gegenfärbung.- 11.8 Eindecken.- 12 Spezifitätskontrollen.- 13 Quantitative Analytik (semiquantitativ versus automatisiert).- Literatur.- XIII Molekularbiologie in der medizinischen Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Allgemeine Grundlagen der Molekularbiologie.- 2.1 Chemischer Aufbau der Nukleinsäuren.- 2.2 Basenpaarung und Komplementarität.- 2.3 Spaltbarkeit der Nukleinsäuren.- 2.4 Aufbau der Gene.- 3 Untersuchung von Nukleinsäuren.- 3.1 Isolierung der Nukleinsäuren.- 3.1.1 DNA Isolierung.- 3.1.2 RNA Isolierung.- 3.2 Ausbeutebestimmung und analytische Überprüfung der Nukleinsauren.- 3.2.1 Messung der optischen Dichte.- 3.2.2 Gelelektrophoresen.- 3.3 Blotverfahren.- 3.3.1 Dot oder Slot Blot.- 3.3.2 Southern Blot.- 3.3.3 Northern Blot.- 3.4 Hybridisierungsverfahren.- 3.4.1 Markierung von Gensonden.- 3.4.2 Durchführung von Hybridisierungen.- 3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR).- 3.5.1 Prinzip der PCR.- 3.5.2 Durchführung einer PCR.- 3.5.3 PCR Amplifikation von RNA nach reverser Transkription (RT-PCR)..- 4 Diagnostische Anwendungsmöglichkeiten.- 4.1 Anwendung des Southern Blots.- 4.1.1 Erkennung von Punktmutationen.- 4.1.2 Nachweis von DNA Polymorphismen.- 4.1.3 Untersuchung von Translokationen und Rearrangements.- 4.2 Anwendungsbeispiele der PCR.- 4.2.1 Identifikation von Mutationen.- 4.2.2 Detektion von Translokationen.- 4.2.3 Amplifikation hochvariabler Regionen in humanen Genen.- 4.2.4 Amplifikationen von DNA in intakten Zellen.- Literatur.- XIV Methoden zum Nachweis und Monitoring einer HIV-Infektion.- 1 Einleitung.- 2 Primäre Untersuchungen zur Feststellung der Seropositivität.- 2.1 Herstellung der Antigene.- 2.2 HIV ELISA.- 2.3 Bestätigungstestverfahren.- 2.3.1 HIV-Westernblot.- 2.3.2 Immunfluoreszenz.- 2.3.3 Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA).- 3 Immunologisches Monitoring bei HIV-Infektion.- 3.1 p24 Antigentest.- 3.2 Neopterin.- 4 Methoden zum direkten Virusnachweis.- 4.1 Viruskultur.- 4.2 Polymerase chain reaction (PCR).- Literatur.